Le principe de fonctionnement d'une pipette Pasteur repose principalement sur un débit et une action capillaire entraînés par la gravité, combinés au contrôle manuel des différences de pression d'air pour faciliter l'aspiration et le transfert des liquides.
Contrôle manuel de l'aspiration : l'opérateur applique une aspiration à l'extrémité large de la pipette-soit oralement, soit à l'aide d'une poire en caoutchouc auxiliaire-pour créer une pression négative à l'intérieur du tube, aspirant ainsi le liquide dans la pointe fine.
Distribution par gravité - : une fois l'aspiration relâchée, le liquide s'écoule naturellement sous l'influence de la gravité ; la distribution peut également être facilitée en pressant doucement le corps de la pipette ou en inclinant le récipient récepteur.
Reproductibilité des gouttelettes : en calibrant le rapport « gouttes par millilitre », la pipette permet un transfert quantitatif approximatif, ce qui la rend adaptée aux procédures qui nécessitent une répétabilité plutôt qu'une précision absolue.
Assurance de la stérilité : avant utilisation, un tampon en coton peut être inséré dans l'extrémité large et stérilisé pour éviter toute contamination microbienne lors de la manipulation-une pratique particulièrement courante dans les expériences microbiologiques.